無菌檢查方法——薄膜過濾法

根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定，當(dāng)供試品的性質(zhì)允許時，包括能直接過濾或者經(jīng)過處理后能過濾的供試品，應(yīng)采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查。薄膜過濾法能有效去除藥物中的抗菌成分，而細(xì)菌及其他微生物則會留在過濾器上。通過對殘留微生物的培養(yǎng)，促進(jìn)其生長與繁殖，定性或定量檢測微生物 。

薄膜過濾法一般采用封閉式薄膜過濾器，根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)，對水溶性液體供試品、水溶性固體和半固體供試品、非水溶性供試品、可溶于十四烷酸異丙醇的膏劑和黏性油劑供試品、無菌氣霧劑供試品、裝有藥物的注射器供試品、具有導(dǎo)管的醫(yī)療器械（輸血、輸液袋等）供試品等多種特性試樣進(jìn)行無菌檢查。

無菌檢查需要滿足的檢測環(huán)境要求

無菌檢查應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無菌檢查的要求，檢驗(yàn)全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。日常檢驗(yàn)需對試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測。通常采用的檢測環(huán)境有以下兩種：

1. B級潔凈度背景下，局部單向流級潔凈度空氣區(qū)域的檢測環(huán)境；

2. 一般區(qū)/CNC/D級潔凈度背景下，采用經(jīng)驗(yàn)證合格的級潔凈度單向流無菌隔離系統(tǒng)的檢測環(huán)境。

單向流空氣區(qū)域、工作臺面及受控環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度確認(rèn)。

薄膜過濾法常見問題匯總

01

供試品溶解

在進(jìn)行固體注射劑（例如密封瓶粉針劑）的無菌檢查時，需先將其溶解、轉(zhuǎn)移并適當(dāng)稀釋，隨后通過薄膜過濾法進(jìn)行過濾處理。在進(jìn)行溶液與稀釋時，溶劑及稀釋液的選擇、配比以及振蕩器的應(yīng)用等因素，均會對供試品的溶解效率與過濾效果產(chǎn)生直接影響。

根據(jù)2020年版《中國藥典》四部無菌檢查法的規(guī)定，推薦的稀釋液包括0.1%無菌蛋白胨水溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液以及0.9%無菌氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)研究顯示，采用前兩種稀釋液時，微生物的回收率顯著高于使用0.9%無菌氯化鈉溶液。若供試品未能充分溶解，過濾時濾膜將會吸附大量供試品顆粒，即便經(jīng)過多次沖洗，這些被吸附的供試品仍難以清除，殘留在濾膜上的供試品會導(dǎo)致陽性菌不能在規(guī)定的條件下生長。

02

集菌培養(yǎng)器選擇不當(dāng)

為了避免操作過程中的人為污染和偏差，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室傾向于采用一次性全封閉集菌培養(yǎng)器對供試品溶液進(jìn)行過濾。在選擇全封閉集菌培養(yǎng)器時，濾膜的材質(zhì)、孔徑及其與供試品的相容性成為影響試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵要素。為確保微生物能被有效截留而不受供試品或其溶劑的干擾，特別是考慮到某些注射劑具有抑菌性并易于被濾膜吸附，應(yīng)選用具有疏水性邊緣和低吸附特性的濾膜，例如尼龍膜材質(zhì)的集菌器。無菌檢查中使用的薄膜過濾器濾膜孔徑應(yīng)不超過0.45微米，此孔徑能有效捕獲微生物。同時，每片濾膜的總過濾量需控制在合理范圍內(nèi)，以防微生物受損。

市場上一次性全封閉集菌培養(yǎng)器的品牌、型號及規(guī)格繁多，適用于不同類型的產(chǎn)品。例如，安瓿瓶裝藥液，可選用配備加長型取樣針的集菌培養(yǎng)器，無需額外轉(zhuǎn)移樣品，即可快速完成檢品的轉(zhuǎn)移；西林瓶裝粉劑則可選擇雙針座設(shè)計的集菌培養(yǎng)器，提供全封閉溶解方案，實(shí)現(xiàn)溶解、過濾、沖洗的一體化操作，避免轉(zhuǎn)移步驟；對于需稀釋的西林瓶裝抑菌性粉劑，三針座設(shè)計的集菌培養(yǎng)器更為合適，它集成了溶解、稀釋、過濾、沖洗的全過程，有助于降低抑菌成分濃度，減少吸附。

檢驗(yàn)人員在挑選集菌培養(yǎng)器時，需綜合考慮產(chǎn)品的溶解度、抑菌程度等因素，以確保達(dá)到預(yù)期的過濾效果。不當(dāng)?shù)倪x擇可能導(dǎo)致沖洗液用量增加，進(jìn)而影響檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

03

沖洗方法不具體

某些注射劑具有較強(qiáng)的抑菌作用，因此，在供試液過濾后，還需通過沖洗液進(jìn)行沖洗，以消除其抑菌效果。然而，一些無菌方法驗(yàn)證報告中的試驗(yàn)操作步驟描述得過于簡略，僅僅列出了沖洗量和沖洗次數(shù)，卻未詳細(xì)記錄沖洗量的確定過程，也未注明沖洗時的流速。事實(shí)上，沖洗流速對實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重要影響：流速過慢可能無法沖洗掉抑菌成分，從而無法有效消除供試品的抑菌作用；而流速過快則可能損傷微生物，導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果無法真實(shí)反映供試品的無菌狀態(tài)。因此，在進(jìn)行無菌檢查時，應(yīng)詳細(xì)記錄沖洗量的確定過程，并嚴(yán)格控制沖洗流速，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

04

培養(yǎng)基儲存不當(dāng)

適用性檢查合格的培養(yǎng)基，若儲存不當(dāng)，會導(dǎo)致其質(zhì)量下降，甚至變得不合格，進(jìn)而影響無菌試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。以無菌檢查中常用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基為例，該培養(yǎng)基能在普通有氧環(huán)境中提供厭氧條件，支持需氧菌和厭氧菌的良好生長，且便于觀察試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》四部規(guī)定，在供試品接種前，培養(yǎng)基的氧化層高度應(yīng)不超過培養(yǎng)基深度的1/3，培養(yǎng)結(jié)束后則不應(yīng)超過1/2。這一要求旨在確保培養(yǎng)基的厭氧層能滿足厭氧菌的生長條件。

培養(yǎng)基氧化層的高度受儲存條件的影響。不同實(shí)驗(yàn)室根據(jù)培養(yǎng)基的使用量，會采取不同的儲存方式。對于使用量較大的實(shí)驗(yàn)室，可能會選擇大批量配制后，采用無菌灌裝并在容器內(nèi)填充氮?dú)?、壓蓋，然后在2～25℃的溫度范圍內(nèi)儲存。而使用量較小的實(shí)驗(yàn)室，則可能采用硅膠塞及紗布包裹瓶口滅菌后，在2～8℃的溫度下避光保存。無論采取何種儲存方式，都需要進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證，以確定最佳的保存條件，從而確保培養(yǎng)基的質(zhì)量始終符合要求。

05

酶的活性降低

在抗生素類注射劑的無菌檢查中，針對抑菌作用較強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，除了應(yīng)用薄膜過濾法外，還可結(jié)合使用中和劑β-內(nèi)酰胺酶，以更有效地消除供試品的抑菌活性。具體操作時，在供試品經(jīng)過過濾和沖洗后，向集菌器中的培養(yǎng)基內(nèi)加入β-內(nèi)酰胺酶，以此中和那些即便經(jīng)過沖洗仍少量吸附于濾膜上、未能去除的供試品活性。β-內(nèi)酰胺酶的使用不僅能減少沖洗液的總量和沖洗次數(shù)，還能防止濾膜上的微生物受損。

值得注意的是，β-內(nèi)酰胺酶的儲存條件對其活力至關(guān)重要，通常應(yīng)在2～8℃下保存。儲存溫度的變化會直接影響酶的活性，因此，實(shí)驗(yàn)室在使用此類酶時，必須嚴(yán)格遵循產(chǎn)品說明進(jìn)行儲存，密切關(guān)注儲存溫度和時長對酶活性的影響。若儲存不當(dāng)導(dǎo)致酶活性降低，而仍按標(biāo)示酶活性計算加入量，則可能無法消除供試品的抗菌作用，從而影響無菌檢查的準(zhǔn)確性。

06

陽性對照菌未按要求加入規(guī)定量

2020年版《中國藥典》明確要求，根據(jù)供試品的特性來選定陽性對照菌。在制備陽性對照實(shí)驗(yàn)的菌液時，其方法與方法適用性實(shí)驗(yàn)相同，且規(guī)定的加菌量不得超過100 cfu。然而，部分廠家為了節(jié)省成本，檢驗(yàn)人員會采用新鮮液體培養(yǎng)基制備菌液，并在初次檢測菌液含菌量符合標(biāo)準(zhǔn)后，便將其儲存于4℃冰箱中供后續(xù)多次使用。在這些后續(xù)的使用過程中，檢驗(yàn)人員并未每次都重新檢測所加入菌液的具體含量，而是直接按照使用時的量來添加。這種做法可能導(dǎo)致實(shí)際加入的陽性對照菌量遠(yuǎn)超規(guī)定值，甚至達(dá)到規(guī)定量的幾倍。盡管在這些條件下陽性菌能夠良好生長，使得實(shí)驗(yàn)表面上看似成立，但實(shí)際上卻掩蓋了實(shí)驗(yàn)可能存在的問題，導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤導(dǎo)性。